Drahtlose Neuromodulation in vitro und in vivo durch intrinsisches TRPC

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1166 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Im letzten Jahrzehnt wurden verschiedene Methoden der magnetischen Tiefenhirnstimulation (DBS) rasch weiterentwickelt, um die Invasivität der DBS zu minimieren. Aktuelle magnetische DBS-Methoden wie die magnetothermische und magnetomechanische Stimulation erfordern jedoch eine Überexpression exogener Ionenkanäle im Zentralnervensystem (ZNS). Es ist unklar, ob magnetomechanische Stimulation nicht-transgene ZNS-Neuronen modulieren kann oder nicht. Hier zeigen wir, dass das Drehmoment magnetischer Nanoscheiben mit einem schwachen und langsamen alternativen Magnetfeld (50 mT bei 10 Hz) Neuronen über die intrinsischen kanonischen Kanäle des transienten Rezeptorpotentials (TRPC) aktivieren könnte, bei denen es sich um mechanosensitive Ionenkanäle handelt, die im Gehirn weit verbreitet sind. Die Immunfärbung mit c-fos zeigt die Steigerung der neuronalen Aktivität durch drahtlose DBS mit magnetomechanischem Ansatz in vivo. Insgesamt demonstriert diese Forschung einen auf magnetischen Nanoscheiben basierenden magnetomechanischen Ansatz, der für die drahtlose neuronale Stimulation in vitro und für ungebundene DBS in vivo ohne Implantate oder genetische Manipulation verwendet werden kann.

Konventionelle elektrische Tiefenhirnstimulation (DBS) wird zur Behandlung neurologischer Störungen eingesetzt, insbesondere motorischer Störungen wie der Parkinson-Krankheit, essentiellem Tremor und anderen Krankheiten1. Der Einsatz elektrischer Stimulation erfordert jedoch invasive chronische Implantationen von Elektroden in die tiefen Hirnregionen2. Um die Invasivität von DBS zu minimieren, wurden akkumulierende Ansätze entwickelt, darunter optische3, akustische4 und elektromagnetische5 neuronale Modulationsansätze. Die Optogenetik nutzte Licht, um die Opsine auf Zielzelltypen zu aktivieren. Das Licht kann jedoch leicht von biologischem Gewebe gestreut und absorbiert werden. Die Implantation von Glasfasern ist notwendig, um Licht in tiefe Gewebe zu transportieren. Der akustische Ansatz mit Ultraschall, wie Sonogenetik und Fokus-Ultraschallstimulation, kann die neuronale Aktivität ohne Hardware-Implantate modulieren. Doch die Ultraschallwellen können an Schädeln und Knochen gestreut, reflektiert und verzerrt werden. Darüber hinaus ist bei der akustischen neuronalen Stimulation die Anbringung von Ultraschallsonden mit einem wässrigen Schädelfenster erforderlich. Von allen physikalischen Ansätzen können nur Magnetfelder ohne Absorption oder Streuung in das Gehirn eindringen6. Transkranielle Magnetstimulation (TMS) ist ein nicht-invasiver neuronaler Stimulationsansatz, bei dem starke Magnetfelder (>1 T) verwendet werden, um elektrische Ströme im Gehirn zu induzieren. Die bei TMS verwendeten starken Magnetfelder können unerwünschte Nebenwirkungen wie Muskelzuckungen, Gesichtsschmerzen und andere Beschwerden verursachen7. Die klinische Anwendung von TMS ist auf die kortikale Stimulation beschränkt, die für DBS nicht verwendet werden kann. Im letzten Jahrzehnt wurde die Verwendung schwacher Magnetfelder für drahtlose magnetische DBS durch den Einsatz magnetischer Nanopartikel-basierter neuronaler Modulationsansätze8,9,10,11,12,13 erreicht.

Die von magnetischen Nanopartikeln über hysteretischen Leistungsverlust bei Anwendung alternativer Magnetfelder bei Hochfrequenz (100 kHz bis 1 MHz) abgeführte Wärme wurde in der Magnetothermogenetik genutzt9. Um die neuronale Aktivität mit magnetothermischen Stimulationen zu manipulieren, wurden der thermosensitive Kationenkanal, Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) oder der thermosensitive Anionenkanal, Anoctamin1, in den Zielneuronen überexprimiert9,10,13. Drahtloses DBS mit Magnetothermogenetik wurde in vivo an frei beweglichen Mäusen demonstriert. Magnetische DBS am Nucleus subthalamicus (STN) mit Magnetothermogenetik könnte das abnormale Verhalten bei Mäusen mit Parkinson-Krankheit retten13. Kürzlich wurde ein weiterer magnetischer Ansatz, die magnetomechanische Stimulation, sowohl im peripheren Nervensystem (PNS) als auch im zentralen Nervensystem (ZNS) demonstriert. Bei diesem Ansatz wurde die mechanische Kraft aus dem Drehmoment magnetischer Nanopartikel oder magnetischer Nanoscheiben bei schwachen und langsamen Magnetfeldern genutzt, um die neuronale Aktivität drahtlos zu stimulieren. Im PNS werden die mechanosensitiven Ionenkanäle Piezo1/2 und TRPV4 in den sensorischen Neuronen stark exprimiert14. Eine Studie zeigte, dass das Drehmoment von ~250 nm magnetischen Nanoscheiben in einem schwachen und langsam variierenden Magnetfeld (<25 mT bei 5 Hz) Ca2+-Reaktionen in mechanosensitiven Neuronen in primären Spinalganglien (DRG) induzieren kann11. Im Gegensatz zum PNS ist das Expressionsniveau von Piezo1/2 in den ZNS-Neuronen sehr niedrig. In der Magnetomechanogenetik wurde Piezo1 in den Zielneuronen im Gehirn überexprimiert. Diese Piezo1-exprimierenden Neuronen könnten durch das Drehmoment magnetischer Nanopartikel mit 500 nm und einem Magnetfeld von 20 mT bei 0,5 Hz stimuliert werden12. Sowohl in der Magnetothermogenetik als auch in der Magnetomechanogenetik sind die möglichen Nebenwirkungen einer Überexpression exogener Gene jedoch noch unbekannt. Auch die viralen Vektoren für die Genübertragung in klinischen Anwendungen gaben Anlass zu Sicherheitsbedenken15,16. Daher haben wir in dieser Studie einen nicht-genetischen Ansatz entwickelt, um die Notwendigkeit einer Genabgabe zu eliminieren.

Das transiente Rezeptorpotential Canonical (TRPC) ist eine nicht-selektive Kationenkanalfamilie, die in verschiedenen Gehirnregionen stark exprimiert wird. Es gibt 3 Untergruppen: TRPC1/4/5, TRPC2 und TRPC3/6/7. Unter ihnen sind Säugetier-TRPC1, 5 und 6 mechanosensitiv und spielen eine Rolle bei dehnungsstimulierten Reaktionen17,18,19. TRPC spielt in Neuronen sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Zuständen mehrere funktionelle Rollen20,21,22,23, einschließlich Neuronenentwicklung, Lernen, Gedächtnis und angstbedingtem Verhalten22,24. TRPC ist an verschiedenen neurologischen Erkrankungen beteiligt, beispielsweise an der Parkinson-Krankheit25, der Huntington-Krankheit26 und dem ischämischen Schlaganfall27. Im Vergleich zu Piezo1/2 erfordert der TRPC eine höhere mechanische Kraft, um aktiviert zu werden28. Es ist unklar, ob magnetomechanische Stimulation intrinsisches TRPC aktivieren kann. In dieser Studie gehen wir davon aus, dass intrinsische TRPC-vermittelte neuronale Reaktionen durch eine etwas stärkere magnetomechanische Stimulation ausgelöst werden könnten als die, die in früheren Studien zur Aktivierung von exogenem Piezo1 verwendet wurde11,12. Was zur neuronalen Modulation in vitro und in vivo genutzt werden kann (Abb. 1a). Um mechanische Kraft auf die Neuronen zu übertragen, wurden in dieser Studie zuvor beschriebene Magnetit (Fe3O4)-Nanoscheiben (MNDs) verwendet11. In Abwesenheit von Magnetfeldern hatten die Wirbelzustände von MNDs eine bessere kolloidale Stabilität in der Lösung. In schwachen Magnetfeldern mit niedriger Frequenz kann die durch das Drehmoment von MNDs erzeugte mechanische Kraft die mechanosensitiven Ionenkanäle auf der Zellmembran aktivieren11.

a Schematische Darstellung der magnetomechanischen Stimulation mithilfe von MNDs. TEM-Bilder von PMAO-beschichteten MNDs (b) und HNDs (c) mit 6 % H2O in der Reaktionslösung im ersten Reaktionsschritt. TEM-Bilder von PMAO-beschichteten MNDs (d) und HNDs (e) mit 8 % H2O in der Reaktionslösung im ersten Reaktionsschritt. f Durchmesser von Nanoscheiben, gemessen anhand von TEM-Bildern (alle Gruppen, n = 10). g Dicke von Nanoscheiben, gemessen anhand von TEM-Bildern (alle Gruppen, n = 10). Die statistische Analyse von Durchmesser und Dicke ist in Tabelle S1-3 dargestellt. h XRD-Spektren von MNDs und HNDs unter verschiedenen Bedingungen. i Das Zeta-Potential von PMAO-beschichteten MNDs (n = 12) und HNDs (n = 9). p = 0,917, Mann-Whitney-Test. Fehlerbalken stellen Mittelwert ± Standardmittelwert des Fehlers (sem) dar.

Superparamagnetische Magnetit-Nanodiscs (MNDs) wurden als Nanotransducer für magnetische neuronale Stimulationen verwendet. Die anisotropen Magnetit-Nanoscheiben wurden nach einem zuvor beschriebenen zweistufigen Syntheseprotokoll 11 synthetisiert (Abb. S1a). Im ersten Schritt wurden die nichtmagnetischen Hämatit (α-Fe2O3)-Nanoscheiben (HNDs) durch ein Solvothermalverfahren in einem Autoklavenreaktor bei 180 °C synthetisiert. Als nächstes wurden die MNDs hergestellt, indem die HNDs unter Beibehaltung der gleichen Größe reduziert wurden. Die Größe einheitlicher HNDs und MNDs kann durch die H2O-Konzentration in der Lösung der ersten Reaktionsstufe eingestellt werden (Abb. 1b – e, S1b). Die Durchmesser der HNDs betrugen 282,8 ± 10,2 nm und 221,0 ± 4,2 nm mit 6 % bzw. 8 % (v/v) H2O in der ersten Schrittreaktion. Die Durchmesser der MNDs betrugen 280,0 ± 5,9 nm und 212,4 ± 7,0 nm, wenn in der ersten Schrittreaktion 6 % bzw. 8 % (v/v) H2O verwendet wurden (Abb. 1f-g). Die Größen und Geometrien von HNDs und MNDs aus demselben Syntheseprozess waren ähnlich (Abb. 1f, g, Tabelle S1–3). Die Röntgenbeugungsspektren (XRD) zeigen, dass die HNDs aus dem ersten Schritt vollständig zu MNDs reduziert wurden (Abb. 1h). In ähnlicher Weise zeigen die Magnetisierungskurven, dass die HNDs durch Anlegen eines externen Magnetfelds nicht magnetisiert werden können (Abb. S1c). Im Gegensatz zu HNDs können MNDs durch ein externes Magnetfeld magnetisiert werden. Die aus dem VSM-Ergebnis berechneten magnetischen Momente von MNDs betragen 8,7 × 10−16 Am2. Um die Funktion von MNDs bei der neuronalen Stimulation zu untersuchen, wurden daher die nichtmagnetischen HNDs in Negativkontrollgruppen verwendet. Nach Berechnungen in einer früheren Studie könnte eine größere mechanische Kraft durch größere magnetische Nanoscheiben erzeugt werden11. Daher verwendeten wir Nanoscheiben mit größeren Durchmessern (>250 nm) zur magnetomechanischen Stimulation in nicht-transgenen Wildtyp-Neuronen (Abb. 1b, c). Um die Nanoscheiben zu funktionalisieren, wurden alle MNDs und HNDs zur neuronalen Stimulation mit Poly(maleinsäureanhydrid-alt-1-octadecen) (PMAO)11 beschichtet. Die negativ geladenen Nanopartikel könnten die Anlagerung von Nanoscheiben an die erregbaren Neuronenzellen fördern29. Das Zetapotential der PMAO-beschichteten Nanoscheiben betrug –53,5 ± 3,7 mV für MNDs und –54,5 ± 2,3 mV für HNDs (Abb. 1i). Die PMAO-beschichteten MNDs und PMAO-beschichteten HNDs wurden für die magnetomechanische neuronale Stimulation bzw. die Kontrollgruppen in dieser Studie verwendet.

Als nächstes wurden MNDs oder HNDs (70 μg/ml) auf die primären Hippocampus-kultivierten Neuronen aufgetragen. Das Rasterelektronenmikroskop-Bild (REM) zeigt, dass sowohl MNDs als auch HNDs an der Membran primärer Hippocampus-Neuronen befestigt waren (Abb. 2a, b). Bei der Ganzzellaufzeichnung konnten wir keinen signifikanten Unterschied des Ruhemembranpotentials zwischen Neuronen mit und ohne negativ geladenen MNDs und HNDs beobachten (Abb. S2a-d). Es gab auch keine signifikanten Unterschiede in den anderen intrinsischen Eigenschaften zwischen den Gruppen (Abb. S2e, f). Für die Magnetstimulation unter einem aufrechten Mikroskop wurde ein speziell für das Fluoreszenzmikroskop entwickeltes Magnetgerät verwendet (Abb. 2c). In der Finite-Elemente-Methode-Magnetik-Simulation (FEMM) wurde ein homogenes 50-mT-Magnetfeld im Zentrum der speziell entwickelten Spule mit 3-A-Stromanwendung erzeugt (Abb. 2d, oben). Das ist sehr ähnlich zu den 50 mT, die von der echten Spule mit 2,8 A Strom gemessen wurden (Abb. 2d, unten). Wir haben keinen offensichtlichen Temperaturanstieg (∆T = 0,20 ± 0,23 °C) bei kontinuierlicher Anwendung von 3 A Strom für 2 Minuten beobachtet. Die neuronalen Aktivitäten wurden mithilfe des Ca2+-Indikators Fluo-4 gemessen. Wir fanden heraus, dass bei der Anwendung von MNDs auf die primär kultivierten Neuronen eine magnetische Stimulation mit 50 mT bei 10 Hz Ca2+-Reaktionen in Neuronen induzieren kann (Abb. 2e, g, h). Im Gegensatz dazu kann das Magnetfeld unter der gleichen Bedingung in den Kontrollgruppen mit HNDs-Anwendung keine Ca2+-Reaktionen auslösen (Abb. 2f–h).

SEM-Bilder von MNDs (a) und HNDs (b) auf der Membran kultivierter Neuronen. c Schematische Darstellung einer magnetischen Vorrichtung für ein Fluoreszenzmikroskop. rechts, die Abmessung der maßgeschneiderten Spule. d Wärmekarten der von der Spule erzeugten Magnetfelder. oben, FEMM-Simulation der Spule mit 3 A Strom. Unten das gemessene Magnetfeld im Inneren der Spule mit 3 A Gleichstrom. Farbkarten der Fluoreszenzintensität von Neuronen mit MNDs (e) oder HNDs (f) Anwendung. Ein Magnetfeld mit 50 mT bei 10 Hz wurde 30 s lang angelegt. g Durchschnittliche Spuren von Ca2+-Reaktionen durch Magnetfeldstimulation. Rote Linie, MND-Gruppe (n = 19/3 (Neuronen/Proben)); Schwarze Linie, HND-Gruppe (n = 13/3); Heller Bereich, sem h Maximale Änderung der Ca2+-Antworten in verschiedenen Gruppen (MND, n = 19/3 (Neuronen/Proben); HND, n = 13/3). ***p < 0,001, Mann-Whitney-Test. Die gemittelten Spuren magnetisch induzierter neuronaler Ca2+-Reaktionen, die durch verschiedene Frequenzen bei 1 Hz (i, n = 46/6 (Neuronen/Proben)), 5 Hz (j, n = 30/6), 10 Hz (k, n = 19/6) oder 20 Hz (l, n = 18/6). Bei jeder Frequenz wurde die Magnetfeldstärke sequentiell von 10 auf 50 mT erhöht. Die grauen Bereiche sind halb. Die Farbbereiche zeigen die Zeiträume der magnetischen Stimulation bei 10 (blau), 20 (cyan), 30 (grün), 40 (rosa) und 50 mT (orange). m Das Maximum ΔF/F0 bei verschiedenen Bedingungen (1 Hz, n = 46/6 (Neuronen/Proben)); 5 Hz, n = 30/6; 10 Hz, n = 19/6; 20 Hz, n = 18/6. F = 9,639, p < 0,001 für Feldintensität, F = 6,155, p < 0,001 für Frequenzen; F = 1,459, p = 0,11 für die Wechselwirkung von Frequenzen und Intensitäten. Zweifaktorielle ANOVA. ***p < 0,001, Tukey-Post-hoc-Test. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar

Um die optimalen Bedingungen für die magnetomechanische Stimulation mit intrinsischen Mechanosensoren zu ermitteln, verglichen wir die neuronalen Reaktionen in den Magnetfeldern mit unterschiedlichen Frequenzen und Feldstärken. Die alternativen Magnetfelder von 1 bis 20 Hz wurden verwendet, um Ca2+-Reaktionen in kultivierten Neuronen mit MND (70 μg/ml) zu induzieren. Bei verschiedenen Frequenzen wurden die Magnetfeldstärken sequentiell von 10 mT auf 50 mT erhöht (Abb. 2i – l, S3). Wir fanden heraus, dass die Ca2+-Reaktionen bei der 50-mT-Simulation deutlich größer waren als bei anderen Magnetfeldintensitäten von 10 bis 40 mT (Abb. 2m). Die Ca2+-Reaktionen bei 5 bis 20 Hz waren deutlich größer als die Reaktionen bei 1 Hz. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Drehmoment der MNDs groß genug war, um mit einer Magnetstimulation von 50 mT neuronale Aktivität auszulösen.

Bei der Stimulation von Neuronen bei 50 mT mit unterschiedlichen Frequenzen (Abb. 3a–d) stellten wir fest, dass 10- und 20-Hz-Stimulationen stärkere Ca2+-Reaktionen hervorriefen als 1- und 5-Hz-Stimulationen (Abb. 3e). Eine 10-Hz-Stimulation könnte eine größere Zellpopulation aktivieren als andere Bedingungen (Abb. 3f). Im Gegensatz dazu kann die Magnetstimulation bei Anwendung von HNDs unter keinen Umständen Reaktionen in Neuronen hervorrufen (Abb. S4a). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass 50 mT bei 10 Hz die optimale Bedingung waren, um Neuronen durch magnetomechanische Stimulation zu aktivieren. Als wir die Magnetstimulation viermal wiederholt anwendeten, beobachteten wir außerdem mehrere Ca2+-Reaktionen in kultivierten Neuronen bei allen Frequenzen (Abb. 3a–d, S4). Nach viermaliger wiederholter magnetischer Stimulation wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mit Propidiumiodid getestet, einem kleinen fluoreszierenden Molekül, das nur in die Zellmembran toter Zellen, nicht aber lebender Zellen eindringen kann30. Wir beobachteten weder bei MNDs noch bei HNDs behandelten Neuronen einen Zelltod nach Stimulation mit unterschiedlichen Frequenzen. (Abb. 3g, h).

Mehrfachstimulationen mit 50 mT bei 1 Hz (a, n = 32/6 (Neuronen/Proben)), 5 Hz (b, n = 51/6), 10 Hz (c, n = 52/6) oder 20 Hz (d, n = 34/6). oben: Heatmap der Ca2+-Reaktionen in einzelnen Neuronen. Die Zellen unterhalb der weißen gestrichelten Linien wurden während der Stimulation aktiviert. Unten: Die gemittelten Spuren der Fluoreszenzänderung. Die hellorangefarbenen Bereiche zeigen die Zeiträume der magnetischen Stimulation an. Rote Linie, MND-Gruppe. Schwarze Linie, HND-Gruppe. Rosa und grauer Bereich, Sem e Die maximale Änderung der Fluoreszenz bei verschiedenen Frequenzen (1 Hz, n = 32/6 (Neuronen/Proben); 5 Hz, n = 51/6; 10 Hz, n = 52/6; 20 Hz, n = 34/6). F = 1,050, p < 0,001, Kruskal-Wallis-Test. f Die Zellaktivitätsrate jeder Kulturprobe bei verschiedenen Häufigkeiten (alle Gruppen, n = 6). F = 8,208, p < 0,001, Kruskal-Wallis-Test. *p < 0,05, ***p < 0,001, Dunn-Post-hoc-Test. g PI-Behandlungen in Neuronen mit MNDs nach magnetomechanischer Stimulation bei 10 Hz. Grün, Fluo-4; Rot, PI. h Quantifizierung des Lebend-Tot-Assays mit Stimulationen bei unterschiedlichen Frequenzen (alle Gruppen, n = 6). F = 0,003, p = 0,995 für die Frequenz; F = 0,003, p = 0,862 für die Art der Nanoscheiben; F = 0,022, p = 0,995 für die Wechselwirkung zwischen Frequenzen und Nanoscheiben, Zwei-Wege-ANOVA. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar

In Säugetierzellen werden mehrere mechanosensierende Kationenkanäle exprimiert. einschließlich Piezo1/2, TRPC, TRPV4, ASIC331,32. Unter ihnen werden TRPC und TRPV4 im CNS31 gemeldet. Im Gegensatz dazu kommen Piezo1/2 und ASIC3 hauptsächlich im PNS32 zum Ausdruck. Um den Mechanismus der MND-vermittelten Reaktionen zu untersuchen, wurde ein pharmakologischer Ansatz verwendet, um die Ionenkanäle zu analysieren, die an den magnetisch stimulierten Reaktionen in Hippocampus-Neuronen beteiligt sind. In TRPC-Unterfamilien gelten TRPC1, 5 und 6 als mechanosensitive Kationenkanäle17,18. Wir fanden heraus, dass ein spezifischer Blocker für TPRC-Unterfamilien, SKF-96365 (50 μM), die magnetomechanisch induzierten Ca2+-Reaktionen eliminierte (Abb. 4a, e, f, S5a, b). Darüber hinaus wurden auch andere unspezifische TRPC-Blocker verwendet, um den Beitrag von TRPC zu untersuchen, darunter GsMTx4, d-GsMTx4 (5 μM) und 2-Aminoethoxydiphenylborat (2-APB). GsMTx4 und d-GsMTx4 sind Antagonisten für Piezo1 bzw. Piezo2. Sie sind auch Antagonisten für TRPC1,5 und 619. 2-APB ist TRPC-Antagonist und TRPV1-3-Agonist, aber unempfindlich gegenüber TRPV433. Ähnlich wie SKF-96365 konnten alle TRPC-Blocker, einschließlich GsMTx4 (5 μM), d-GsMTx4 (5 μM) und 2-APB (100 μM), die magnetomechanisch induzierten Reaktionen in Hippocampus-Neuronen eliminieren (Abb. 4b–f, S5a, b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass intrinsisches TRPC in Neuronen des Hippocampus eine entscheidende Rolle bei magnetomechanischen Stimulationen spielt.

Die Ca2+-Reaktionen durch mehrfache magnetomechanische Stimulation mit Badanwendung von SKF-96365 bei 50 μM (a, n = 26/6 (Neuronen/Proben)), GsMTx4 bei 5 μM (b, n = 19/6), d-GsMTx4 bei 5 μM (c, n = 19/6) und 2-APB bei 100 μM (d, n = 36/6). Die magnetischen Stimulationen betragen 30 s lang 50 mT bei 10 Hz. Die Intervalle zwischen den Stimulationen betragen 60 s. Oben: Heatmap der Reaktionen einzelner Zellen. Die Zellen unterhalb der weißen gestrichelten Linien wurden während der Stimulation aktiviert. unten, gemittelte Fluoreszenzänderungen. Die hellorangefarbenen Bereiche zeigen die Zeiträume der magnetischen Stimulation an. Die grauen Bereiche sind Sem e Maximale Fluoreszenzänderungen von mit MNDs behandelten Neuronen mit verschiedenen TRPC-Blockern bei der ersten magnetischen Stimulation (Kontrolle, n = 52/6 (Neuronen/Proben); SKF-96365, n = 26/6; GsMTx4, n = 19/6; d-GsMTx4, n = 19/6; 2-APB, n = 36/6). F = 146,799, p < 0,001, Kruskal-Wallis-Test. f Die Zellaktivitätsrate von MNDs, die Neuronen mit verschiedenen TRPC-Blockern bei der ersten magnetischen Stimulation behandelt wurden (alle Gruppen, n = 6). F = 29,017, p < 0,001, Kruskal-Wallis-Test. **p < 0,01, ***p < 0,001, im Vergleich zur Kontrollgruppe; Dunn Post-hoc-Test. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar

Als nächstes wurde die Rolle von TRPV4, einem weiteren mechanosensitiven Ionenkanal, bei der magnetomechanischen Stimulation in Hippocampus-Neuronen durch Anwendung des TRPV4-spezifischen Blockers HC-06704711 untersucht. Wir fanden heraus, dass HC-067047 (1 μM) die MND-vermittelten Reaktionen nicht modulieren konnte (Abb. 5a, f, g, S5c, d). Dies weist darauf hin, dass die magnetisch stimulierten Reaktionen nicht durch TRPV4 vermittelt wurden. Der spannungsgesteuerte Natriumkanalblocker (VGSC) Tetrodotoxin (TTX; 100 nM) wurde verwendet, um zu untersuchen, ob Aktionspotentiale an den magnetomechanisch induzierten Ca2+-Reaktionen beteiligt sind. Die ersten stimulationsinduzierten Ca2+-Reaktionen und Zellaktivitäten werden durch die TTX-Anwendung nahezu eliminiert (Abb. 5b, f, g). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die magnetomechanisch stimulierte TRPC-Aktivierung Aktionspotentiale in Neuronen induzieren könnte. Interessanterweise wurden die maximalen Fluoreszenzänderungen und das Zellaktivitätsverhältnis bei Mehrfachstimulation durch die TTX-Anwendung deutlich reduziert, aber nicht vollständig aufgehoben (Abb. S5c, d). Diese TTX-unabhängigen Ca2+-Reaktionen könnten von anderen aktionspotentialunabhängigen Ca2+-Kanälen beigetragen werden. TRPC ist als unspezifischer Kationen-Ionenkanal mit Ca2+-Permeabilität bekannt. Die TTX-unabhängigen Ca2+-Reaktionen könnten durch TRPC allein oder durch andere spannungsgesteuerte Ca2+-Kanäle (VGCC) beigetragen werden. Unter allen VGCC sind T-Typ-VGCC und CaV1.3 von L-Typ-VGCC aktivierte Ionenkanäle mit niedrigem Schwellenwert. Um zu untersuchen, ob VGCC an magnetomechanisch stimulierten Reaktionen beteiligt sind, wurden Antagonisten von L-Typ- und T-Typ-VGCC während mehrerer magnetomechanischer Stimulationen angewendet. Nifedipin und Mibefradil werden üblicherweise als spezifischer VGCC-Antagonist vom L-Typ bzw. als spezifischer VGCC-Antagonist vom T-Typ bezeichnet. Es häufen sich jedoch Hinweise darauf, dass es sich um unspezifische Antagonisten handelt, die sowohl L-Typ- als auch T-Typ-VGCC34 blockieren können. Durch die Verwendung von Nifedipin (10 μM)35 kam es bei mehreren Magnetstimulationen fast zu keinen Ca2+-Reaktionen (Abb. 5c, f, g, S5c, d). In ähnlicher Weise wurden bei der Anwendung von Mibefradil (3 μM)36 die Ca2+-Reaktionen durch mehrfache Magnetstimulation signifikant reduziert (Abb. 5d, f, g, S5c, d). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die magnetomechanisch induzierte TRPC-Aktivierung VGCC auslösen könnte. Die TTX-unabhängigen Ca2+-Reaktionen werden möglicherweise nicht allein durch den Ca2+-Zustrom durch TRPC verursacht. Schließlich wurden mit Ca2+-freier extrazellulärer Lösung alle magnetomechanisch induzierten Ca2+-Reaktionen eliminiert (Abb. 5e–g, S5c, d). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Ca2+-Reaktionen durch den Ca2+-Zustrom aus der externen Lösung verursacht wurden (Abb. 5h). Insgesamt haben wir aus der pharmakologischen Studie herausgefunden, dass das durch ein alternatives Magnetfeld erzeugte Drehmoment von MND den Ca2+-Einstrom aus der externen Lösung induzieren kann. Die hauptsächlich durch VGCCs und Aktionspotentiale in kultivierten Neuronen verursacht wurden. Die SKF-96365-, GsMTx4- und d-GsMTx4-Experimente zeigen, dass diese magnetomechanisch stimulierten Reaktionen hauptsächlich durch intrinsisches TRPC vermittelt wurden (Abb. 4a – f, S5a, b).

Die Ca2+-Reaktionen durch mehrfache magnetomechanische Stimulation mit Badanwendung von HC-067047 bei 1 μM (a, n = 38/6 (Neuronen/Proben)), TTX bei 100 nM (b, n = 44/6), Nifedipin bei 10 μM (c, n = 107/6), Mibefradil bei 3 μM (d, n = 50/7) und Ca2+-freie Lösung (e, n = 79/8). Die magnetischen Stimulationen betragen 30 s lang 50 mT bei 10 Hz. Die Intervalle zwischen den Stimulationen betragen 60 s. Oben: Heatmap der Reaktionen einzelner Zellen. Die Zellen unterhalb der weißen gestrichelten Linien wurden während der Stimulation aktiviert. unten, gemittelte Fluoreszenzänderungen. Die hellorangefarbenen Bereiche zeigen die Zeiträume der magnetischen Stimulation an. Die grauen Bereiche sind sem f. Die maximalen Fluoreszenzänderungen bei der ersten magnetischen Stimulation (Kontrolle, n = 52/6 (Neuronen/Proben); HC-067047, n = 38/6; TTX, n = 44/6; Nifedipin, n = 107/6; Mibefradil, n = 50/7; Ca2+-frei, n = 79/8). F = 135,911, p < 0,001, Kruskal-Wallis-Test. g Die Zellaktivitätsrate bei der ersten magnetischen Stimulation (Kontrolle, n = 6; HC-067047, n = 6; TTX, n = 6; Nifedipin, n = 6; Mibefradil, n = 7; Ca2+-frei, n = 8 ). F = 30,674, p < 0,001, Kruskal-Wallis-Test. h Schematische Darstellung des Mechanismus MND-vermittelter Reaktionen. **p < 0,01, ***p < 0,001, im Vergleich zur Kontrollgruppe; ##p < 0,01, ###p < 0,001, verglichen mit der HC-067047-Gruppe; Dunn Post-hoc-Test. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar

Der Nucleus subthalamicus (STN) ist das klinische Ziel der konventionellen DBS mit elektrischer Stimulation zur Behandlung von Patienten mit Parkinson-Krankheit37. Mithilfe der Immunhistochemie beobachteten wir, dass alle mechanosensitiven TRPC, einschließlich TRPC1, 5 und 6, im STN von Mäusen exprimiert wurden (Abb. 6a – c). Diese Ergebnisse ähneln einem früheren Bericht über die TRPC-Expression im STN von Ratten38. Um die magnetomechanische neuronale Modulation für DBS in STN in vivo zu untersuchen, wurden Nanoscheiben (2 μl von 1 mg/ml) einseitig in STN von Mäusen injiziert (Abb. 7a). Die Injektionskoordinate wurde durch Verwendung fluoreszenzmarkierter MNDs bestätigt (Abb. S6a, b). Nach der Injektion wurden die fluoreszenzmarkierten MNDs mindestens 5 Tage lang weder abgebaut noch metabolisiert (Abb. S6c, d). Zur drahtlosen neuronalen Stimulation wurden PMAO-beschichtete MNDs und HNDs ohne Fluoreszenz in dieselbe Koordinate am STN injiziert. 5 bis 7 Tage nach der Injektion wurden die mit Nanoscheiben injizierten Mäuse in einen großen, speziell angefertigten Magnetapparat mit 20 cm Innendurchmesser und 25 cm Höhe gegeben (Abb. 7b). Dieses magnetische Gerät bestand aus 4 runden Spulen (20 cm Innendurchmesser, 28 cm Außendurchmesser und 5 cm Höhe), die von 4 Sätzen Treibern und Netzteilen gesteuert wurden. Die FEMM-Simulation zeigte, dass das Magnetfeld in der Mitte der Spule bei 10 A Strom 50 mT beträgt (Abb. 7c). Das vom Zentrum der maßgeschneiderten Spule gemessene Magnetfeld beträgt 50 mT bei 10 A Stromanwendung (Abb. 7d). Die Temperatur der Spule stieg um weniger als 1 °C an, wenn 2 Minuten lang ein Strom von 10 A angelegt wurde (∆T = 0,70 ± 0,15 °C an der Wand; ∆T = 0,83 ± 0,14 °C in der Mitte). Die wachen Mäuse wurden durch das Magnetfeld mit 50 mT bei 10 Hz mit einem 30-s-An-/30-s-Aus-Zyklus für 10 Minuten stimuliert (Abb. 7a, b). Wir fanden heraus, dass die Expression des unmittelbar frühen Gens c-fos bei MNDs, denen STN injiziert wurde, signifikant größer war als bei kontralateralem STN (Abb. 7e – g). Im Gegensatz dazu gab es keinen Unterschied zwischen der c-fos-Expression von ipsilateralem und kontralateralem STN von Mäusen, denen HNDs injiziert wurden (Abb. 7h, S7a – b). Das ipsilaterale/kontralaterale Verhältnis der c-fos-Expression in STN von MNDs-injizierten Mäusen war ebenfalls signifikant höher als in HNDs-injizierten Gruppen (Abb. 7i). Der entopedunkuläre Kern (EP) ist eines der glutamatergen projizierenden STN-Neuronen bei Mäusen. Und es ist homolog zum inneren Globus Pallidus (GPi) beim Menschen. Ähnlich wie bei STN waren die c-fos-Expressionen im ipsilateralen EP von Mäusen, denen MNDs injiziert worden waren, signifikant höher als im kontralateralen EP (Abb. 7j, S7c, d). Bei Mäusen, denen HNDs injiziert wurden, gab es jedoch keinen Anstieg der c-fos-Expression in EP (Abb. 7k, S7e, f). Das ipsilaterale/kontralaterale Verhältnis der c-fos-Expression im EP von MND-injizierten Mäusen war ebenfalls signifikant höher als bei HND-injizierten Gruppen (Abb. 7l). In früheren Studien, bei denen die STN von gesunden Wildtyp-Mäusen ohne Parkinson-Krankheit einseitig stimuliert wurde, waren die Ergebnisse zum Rotationsverhalten umstritten. Hier haben wir bei wachen Mäusen mit drahtlosen Magnetstimulationen unter diesen Bedingungen kein offensichtliches Rotationsverhalten beobachtet (Abb. S8). Die Ergebnisse der c-fos-Färbung zeigen, dass wir durch die Verwendung des magnetomechanischen Ansatzes mit MNDs in der Lage waren, den neuronalen Schaltkreis in der tiefen Hirnregion in vivo drahtlos zu modulieren.

a Immunfärbung von NeuN (rot), TRPC1 (grün), DAPI (blau) und zusammengeführtes Bild in STN. Eingefügtes, vergrößertes zusammengefügtes Bild eines Neurons. b Immunfärbung von NeuN (rot), TRPC5 (grün), DAPI (blau) und zusammengeführtes Bild in STN. Eingefügtes, vergrößertes zusammengefügtes Bild eines Neurons. c Immunfärbung von NeuN (rot), TRPC6 (grün), DAPI (blau) und zusammengeführtes Bild in STN. Eingefügtes, vergrößertes zusammengefügtes Bild eines Neurons.

a Schematische Darstellung der magnetomechanischen Stimulation bei STN in vivo. Nanoscheiben wurden einseitig in STN injiziert. Unten: Zeitleiste der stereotaktischen Injektion, Magnetstimulation und C-FOS-Färbung b Schematische Darstellung eines drahtlosen Magnetstimulationsgeräts für die magnetomechanische Stimulation in vivo. Unten: Zeitleiste für die Magnetstimulation. c FEMM-Simulation des In-vivo-Magnetapparats mit 10 A Strom. Die schwarze Linie markiert die Zylinderkammer für Mäuse. d Die Messung des Magnetfelds anhand der weißen gestrichelten Linie zeigt den Bereich in c an. Immunfärbung von NeuN (rot), c-fos (grün), DAPI (blau) und zusammengeführtes Bild von ipsilateralem STN (e) und kontralateralem STN (f) von Mäusen, denen MND injiziert wurde. g c-fos/NeuN von STN in MND-injizierten Mäusen (n = 9). h c-fos/NeuN von STN in HND-injizierten Mäusen (n = 7). i Der Unterschied von c-fos/NeuN zwischen ipsilateralem und kontralateralem STN bei Mäusen, denen Nanoscheiben injiziert wurden. j c-fos/NeuN von EP in MND-injizierten Mäusen (n = 9). k c-fos/NeuN von EP in HND-injizierten Mäusen (n = 7). l Der Unterschied von c-fos/NeuN zwischen ipsilateralem und kontralateralem EP bei Mäusen, denen Nanoscheiben injiziert wurden. **p < 0,01, ***p < 0,001, ns, keine Signifikanz. Wilcoxon-Signed-Rank-Test für gepaarte Daten in (g), (h), (j) und (k). Mann-Whitney-Test für ungepaarte Daten in i und l. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar

Zusammenfassend stellten wir fest, dass bei Anwendung schwacher und langsamer alternativer Magnetfelder (50 mT bei 10 Hz) die von magnetischen Nanoscheiben erzeugte mechanische Kraft die Aktivität von Wildtyp-Neuronen induzierte, ohne exogene Gene zu überexprimieren. Wir zeigen, dass diese magnetomechanischen Reaktionen hauptsächlich durch den intrinsischen mechanosensitiven Kationenkanal TRPC vermittelt wurden. Schließlich wurden die Aktivitäten tiefer Hirnregionen durch MND-vermittelte magnetomechanische Stimulation bei wachen Mäusen in vivo gesteigert. Aktuelle Studien zur magnetomechanischen Stimulation bei Piezo1-exprimierendem DRG oder zur Überexpression von Piezo1 im ZNS erfordern nur <23 mT bei 1–5 Hz. In Übereinstimmung mit früheren Berichten konnten wir in Neuronen ohne Piezo1/2- oder TRPV4-Überexpression keine offensichtlichen Reaktionen mit Magnetfeldern bei <40 mT beobachten (Abb. 2i – m). Die Magnetfeldstärke zur Induktion der TRPC-Aktivität ist in unserer Studie größer (50 mT) als in früheren Untersuchungen. Dies steht im Einklang mit dem vorherigen Bericht, dass TRPC eine stärkere mechanische Kraft erfordert als Piezo128. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass TRPC indirekt durch mechanische Stimulation aktiviert wird39, wenn wir magnetomechanische Stimulation mit MNDs anwenden.

Die MNDs und HNDs in dieser Studie waren mit PMAO funktionalisiert und trugen negative Oberflächenladungen (Abb. 1i). Frühere Studien zeigen, dass die negativ geladenen Nanopartikel die Anlagerung des Partikels an der erregbaren neuronalen Membran erleichtern können, nicht jedoch an der nicht erregbaren Gliamembran11,29. Im Gegensatz dazu können sich positiv geladene oder neutrale Nanopartikel nicht an den neuronalen Membranen festsetzen29. Obwohl die negativ geladenen Nanopartikel an der Oberfläche der neuronalen Membran die Erregbarkeit erhöhen könnten29, konnten wir weder in vitro noch in vivo einen signifikanten Anstieg des Ruhemembranpotentials und der neuronalen Aktivität beobachten. Erstens gibt es in kultivierten Hippocampus-Neuronen mit negativ geladenen HNDs keine Ca2+-Reaktionen (Abb. 2e–h). Bei der Ganzzellaufzeichnung waren die Ruhemembranpotentiale von mit MNDs und HNDs behandelten Neuronen nicht signifikant höher als bei Kontrollgruppen ohne Nanoscheiben (Abb. S2a – c). Schließlich wiesen die neuronalen Aktivitäten in vivo im STN und seinem nachgeschalteten EP von Mäusen, denen einseitig HNDs injiziert wurden, bei der c-fos-Immunfärbung keine Unterschiede zwischen der ipsilateralen und der kontralateralen Hemisphäre auf (Abb. 7h, k). Dennoch wird eine weitere Modifikation der Oberfläche von Nanoscheiben erforderlich sein, um die spezifische Bindung von Nanoscheiben an die gezielten TRPC-Kanäle oder an die gezielten Neuronen durch Modifizierung der Oberfläche der Nanoscheiben zu erhöhen.

Die meisten der kürzlich entwickelten ungebundenen DBS-Methoden, einschließlich Optogenetik, Chemogenetik, Sonogenetik und Magnetogenetik, nutzen genetische Werkzeuge, um exogene Gene in den Zielhirnregionen zu überexprimieren. Allerdings schränken die regulatorischen Barrieren der genetischen Methoden, die in diesen Methoden verwendet werden, die translationalen Anwendungen dieser DBS-Ansätze bei menschlichen Patienten ein. Der hier demonstrierte magnetomechanische DBS-Ansatz ist ein transgenfreier Ansatz, bei dem keine Sicherheitsbedenken bestehen, die mit der Verwendung viraler Vektoren für die Genabgabe verbunden sind. Diese Studie zeigt nicht nur die Aktivierung von intrinsischem TRPC durch magnetomechanische Stimulation, sondern auch, dass die durch mechanische Kraft induzierte Aktivierung von intrinsischem TRPC Aktionspotentiale auslösen und den VGCC in Neuronen aktivieren könnte (Abb. 4, 5). Mit TTX wurden die MNDs-induzierten Reaktionen deutlich reduziert. Und es weist darauf hin, dass MNDs Aktionspotenziale in Neuronen auslösen können. Interessanterweise blieben TTX-unabhängige Ca2+-Reaktionen bestehen, wenn Neuronen durch mehrfache magnetomechanische Stimulation stimuliert wurden. Dadurch könnten mehr Ca2+-durchlässige Ionenkanäle rekrutiert werden. VGCC mit niedrigem Schwellenwert, einschließlich VGCC vom T-Typ und CaV1.3 von VGCC vom L-Typ, werden im Soma und Dendrit von Hippocampus-Neuronen stark exprimiert40,41. Durch die Verwendung von VGCC-Blockern stellten wir fest, dass diese verbleibenden magnetomechanisch induzierten Ca2+-Reaktionen durch die Aktivierung von T-Typ- und L-Typ-VGCC verursacht wurden. Allerdings konnten wir keinen offensichtlichen Ca2+-Einstrom über TRPC beobachten. Obwohl TRPC-Familien Kationenkanäle mit Kalziumpermeabilität sind. Die Ca2+-Permeabilität hängt von der Untereinheitenzusammensetzung des TRPC-Heteromers ab. Die Ca2+-Permeabilität heteromerer TRPC, wie TRPC1/5 und TRPC1/6, kann durch die TRPC1-Untereinheit reduziert werden42,43. Diese heteromeren TRPC mit den Untereinheiten TRPC1, 5 und 6 werden im Hippocampus und STN stark exprimiert. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um zu verstehen, welche Zusammensetzungen der TRPC-Untereinheiten mit der magnetomechanischen Stimulation zusammenhängen. Das Verständnis der Expression der TRPC-Untereinheiten in den Zielhirnregionen und Zielzelltypen ist auch für zukünftige Anwendungen von entscheidender Bedeutung.

Bei Parkinson-Erkrankungen kann DBS bei STN das abnormale Verhalten beheben1. Bei gesunden WT-Mäusen ist der Zusammenhang zwischen Tierverhalten und DBS bei STN jedoch unklar. Eine Studie zeigt, dass die Aktivierung von STN durch Optogenetik eine ipsilaterale Rotation bei WT-Mäusen auslösen kann44. Im Gegensatz dazu zeigt eine andere Studie, dass die Stimulierung von STN mit Magnetothermogenetik die kontralaterale Rotation bei WT-Mäusen erhöht13. Diese Studien zeigen sehr kontroverse Ergebnisse der DBS bei STN bei Mäusen ohne Parkinson-Krankheit. Der Unterschied dieser kontroversen Ergebnisse könnte mit den Neuromodulationsmethoden und Stimulationsintensitäten zusammenhängen. In dieser Studie wird das Rotationsverhalten von MND-injizierten Mäusen durch MND-vermittelte magnetomechanische DBS bei STN bei wachen Mäusen nicht verändert. Dennoch stellten wir bei der Immunfärbung von c-fos eine Steigerung der neuronalen Aktivität bei den WT-Mäusen mit drahtloser magnetomechanischer DBS fest. Unsere Forschung zeigt einen Machbarkeitsnachweis für die drahtlose Stimulation neuronaler Aktivität in vivo. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Parameter magnetomechanischer Stimulationen in vivo zu optimieren. Die Regulierung der TRPCs wurde bereits zur Behandlung der Parkinson-Krankheit25 und des ischämischen Schlaganfalls27 vorgeschlagen. Leider sind die funktionellen Rollen von TRPCs in den meisten Gehirnregionen nicht gut charakterisiert. Die Unterschiede der funktionellen Rollen von TRPC in verschiedenen Gehirnregionen und Zelltypen müssen für zukünftige Anwendungen berücksichtigt werden. Weitere translationale Studien sind erforderlich, um die mögliche Anwendung der magnetomechanischen Stimulation bei Parkinson und anderen neurologischen Erkrankungen herauszufinden.

Abgesehen von genetisch basierten Neuromodulationsansätzen erfordern einige transgenfreie, drahtlos betriebene Miniatur-DBS-Geräte immer noch Hardwareimplantationen im Millimeter- bis Zentimeterbereich in die tiefen Hirnregionen45,46. Bei der transgenfreien neuronalen Modulation im Nanomaßstab zeigt eine Studie, dass eine Magnetstimulation mit einem Gleichstrommagnetfeld von 200 mT und einem Wechselstrommagnetfeld von 6 mT bei 140 Hz piezoelektrische Kobaltferrit-Bariumtitanat-Nanopartikel für drahtlose DBS in frei beweglichen Mäusen in vivo aktivieren kann47. Im Vergleich dazu benötigt das magnetomechanische DBS in dieser Studie nur das schwache Magnetfeld mit 50 mT bei sehr niedriger Frequenz (10 Hz). Somit ist die magnetische Vorrichtung zur Erzeugung homogener Magnetfelder im Bereich der magnetomechanischen Stimulation auf größere Volumina skalierbar. Die maßgeschneiderte Spule für In-vitro- und In-vivo-Experimente in dieser Studie hatte einen Innendurchmesser von 3,5 cm bzw. 20 cm (Abb. 2c, 7b). Es kann in die meisten Mikroskopsysteme und Tierverhaltensgeräte integriert werden. Die skalierbare Funktion dieses Ansatzes ist ideal für zukünftige Anwendungen in größeren Tiermodellen oder beim Menschen. Darüber hinaus sind magnetische Nanopartikel aus Eisenoxid bereits als Kontrastmittel in der Magnetresonanztomographie (MRT) klinisch zugelassen6. Die magnetischen Eisenoxid-Nanoscheiben in dieser Studie haben eine ähnliche Chemie wie die klinisch zugelassenen Nanopartikel. Daher ist diese Arbeit ein wichtiger Proof-of-Concept für transgenfreie Remote-DBS mit magnetomechanischer Stimulation, der vielversprechend für die Entwicklung zukünftiger translationaler Anwendungen für menschliche Patienten ist.

Der Syntheseprozess von Nanoscheiben folgt dem in der vorherigen Studie11 beschriebenen Protokoll. Der Syntheseprozess besteht aus zwei Schritten. Zunächst wurden Hämatit-Nanoscheiben durch Mischen von 10 ml 99,5 %igem Ethanol, 0,6 ml ddH2O (oder 0,8 ml ddH2O für kleinere Nanoscheiben), 0,8 g wasserfreiem Natriumacetat (Sigma-Aldrich) und 0,273 g FeCl3·6H2O (Sigma-Aldrich) synthetisiert. . Nachdem die Mischung durch Rühren homogenisiert wurde, wurde die Mischung in ein mit Teflon ausgekleidetes Stahlgefäß überführt und verschlossen. Das Gefäß wurde 18 Stunden lang im Ofen auf 180 °C erhitzt. Die Hämatit-Nanoscheiben wurden zweimal mit ddH2O gewaschen. Anschließend wurden die Nanoscheiben zweimal mit Ethanol gewaschen. Nanoscheiben wurden in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Hämatit-Nanoscheiben wurden weiter in Magnetit-Nanoscheiben umgewandelt oder für Kontrollexperimente verwendet. Zur Reduktion wurden 1 mg Hämatit-Nanoscheiben mit 20 ml Trioctylamin (Acros Organics) und 1 g Ölsäure (Sigma-Aldrich) gemischt. Die Mischung wurde in einen Dreihalskolben gegeben, der an eine Schlenk-Leitung angeschlossen war, und in einer Atmosphäre aus H2 (5 % mit 95 % Argon, Chiah Lung) und N2 (99,9 %, Chiah Lung) 25 Minuten lang auf 370 °C erhitzt. Während der Reduktion verfärbten sich die roten Hämatit-Nanoscheiben dunkelgrau. Nach dem Abkühlen wurden die Scheiben mit Hexan (Alfa Aesar) gewaschen. Die Magnetit-Nanoscheiben wurden dann in Chloroform (JT Baker) dispergiert und in einem Glasfläschchen bei 4 °C gelagert.

Sowohl MND als auch HND sind mit einer PMAO-Beschichtung funktionalisiert. Vor der PMAO-Beschichtung wurden Nanoscheiben in Chloroform in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Zunächst wurden 10 mg 30.000 MW PMAO (419117, Sigma-Aldrich) in 1 ml Chloroform gelöst. Getrocknetes 1 mg MND- oder HND-Pulver wurde dem PMAO-haltigen Chloroform zugesetzt. Die Mischung wurde 1 Stunde lang beschallt, bis die Nanoscheiben gut suspendiert waren. Anschließend wurden die PMAO-beschichteten Nanoscheiben über Nacht in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Die getrockneten Nanoscheiben wurden in den TAE-Puffer (Tris-Acetat-EDTA, Biomate) mit einer Konzentration von 25 % (Gew./Vol.) gegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden lang bei 80 °C mit Ultraschall behandelt. Nach der Ultraschallbehandlung wurde es mit einer Mikrozentrifuge 10 Minuten lang bei 8500 U/min pelletiert. Der Überstand wurde entfernt und erneut mit ddH2O aufgefüllt. Wiederholte die Prozesse von der Beschallung des Brunnens bis zur ddH2O-Nachfüllung dreimal. Zur Visualisierung von Nanoscheiben in den Hirnschnitten wurden fluoreszenzmarkierte PMAO-beschichtete MNDs hergestellt, indem 200 μl Neutravidin (Thermo Scientific) mit 200 μl Alexa Fluor 594-Farbstoff (Thermo Scientific) zwei Stunden lang gemischt wurden. Anschließend wurden zwei Stunden lang 10 mg MNDs zur Neutravidin-Farbstoff-Mischung hinzugefügt.

Nanoscheiben in Chloroform wurden in einem Vakuumexsikkator getrocknet und dann in ddH2O gelöst. Die wässrigen Nanoscheiben wurden auf ein Kupfergitter (Ted Pella Inc.) gelegt und die Morphologie der Scheiben mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sichtbar gemacht. Die TEM wurde mit HT7800 (Hitachi) vom Mikroskopie-Kernlabor des Chang Gung Memorial Hospital (CGMH) durchgeführt. Durchmesser und Dicke der Nanoscheiben wurden mit ImageJ anhand eines TEM-Bildes gemessen. Jede sechseckige Nanoscheibe wurde in drei Diagonalen gezeichnet und der längste Abstand wurde als Messung des Nanoscheibendurchmessers ausgewählt. Nanoscheibenpulver wurden durch Röntgenbeugung (XRD) nachgewiesen, um die Struktur der Materialien zu bestätigen. XRD wurde mit XtaLAB Synergy DW (Rigaku) vom Instrumentation Center der National Tsing Hua University (NTHU) durchgeführt. Hämatit oder Magnetit wurden mit N-Fett (Apiezon) gemischt und auf MicroMeshesTM (MiTeGen) gesammelt, gekoppelt an den 150° gebogenen Hybrid-Photonenzähl-Röntgendetektor HyPix-Arc mit graphitmonochromatisierter Mo-Kα-Strahlung (λ = 0,71073 Å) bei 100 K Zur Untersuchung der Sättigungsmagnetisierung (Ms) von Nanoscheiben wurde ein Vibrationsprobenmagnetometer verwendet, um Hysteresekurven im Bereich von ± 9 kOe zu messen. Magnetische Momente von Nanoscheiben wurden mit dem MPMS SQUID Vibrating Sample Magnetometer (VSM; Quantum Design) vom Core Facility Center der National Cheng Kung University (NCKU) gemessen. Darüber hinaus wurde ein optisches Emissionsspektrometer mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES) Agilent 725 zur Quantifizierung der Eisenelementkonzentration für die Berechnung des magnetischen Moments verwendet, die vom Instrumentation Center der NTHU durchgeführt wurde. Zur Berechnung des magnetischen Moments folgten wir der Formel aus der vorherigen Studie11:

μ ist das magnetische Moment. V ist das Volumen der Nanoscheiben, das mit TEM gemessen wurde. ρ ist die Dichte von Magnetit (Fe3O4)11. Ms ist die Sättigungsmagnetisierung, die vom VSM gemessen wird. Das magnetische Moment von MNDs ist:

Zur Erkennung potenzieller Eigenschaften wurden PMAO-beschichtete Nanoscheiben, gelöst in ddH2O, verwendet. Das Zetapotential wurde durch elektrophoretische Lichtstreuung mit dem DelsaTM Nano C Particle Analyzer (Beckman Coulter) gemessen. 3,5 μl 20 mg/ml PMAO-beschichtete Nanoscheiben wurden nach 7 Tagen in vitro (DIV) für 15 Minuten auf Hippocampus-Neuronen geladen, um Nanoscheiben an Zellmembranen zu befestigen. Verwenden Sie dann 1× PBS (Gibco), um dreimal mit dem Fixierungspuffer von CGMH (3 % Glutaraldehyd, 2 % Paraformaldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer) zu waschen. Fixierte Proben wurden in einem Gefrierschrank bei 4 °C gelagert, bis mithilfe der Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM) die Anlagerung von Nanoscheiben an Neuronen aufgezeichnet wurde. FE-SEM wurde mit SU8220 (Hitachi) vom Mikroskopie-Kernlabor der CGMH durchgeführt. FE-SEM wurde verwendet, um Nanoscheiben, die an Neuronen haften, bei 2000-facher Vergrößerung und die Oberflächenmerkmale der Nanoscheiben bei 30.000-facher Vergrößerung aufzuzeichnen.

Alle Tierversuchsverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der National Yang Ming Chiao Tung University (NYCU) genehmigt. Alle trächtigen Sprague-Dawley-Ratten wurden von LASCO gejagt. Die Jungtiere von Sprague-Dawley-Ratten nach der Geburt (<3 Tage) wurden für die primäre Hippocampuskultur verwendet. Hippocampi wurden in kalter Dissektionslösung (160 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 4 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 5,5 mM Glucose, pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,4 eingestellt) extrahiert. Nach der Extraktion wurden Hippocampi von 2 bis 3 Jungtieren gemischt und in vorgewärmte Verdauungslösung (1 mM L-Cystein, 0,5 mM EDTA, 1 mM CaCl2, 1,5 mM NaOH und 10 Einheiten/ml Papain (76220, Sigma-Aldrich)) überführt. . Die Mischung wurde 25 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Papain wurde inaktiviert, indem die Verdauungslösung entfernt und die Gewebe in Inaktivierungslösungen (0,25 % Rinderalbumin und 0,25 % Trypsininhibitor), 0,4 % D-Glucose und 5 % fötales Rinderserum (6140079, Gibco) in Minimum Essential Medium (MEM) inkubiert wurden mit Earle-Salzen ohne L-Glutamin; 11090-081, Gibco) bei 37 °C für 2 Minuten. Nach dem Entfernen der Inaktivierungslösung wurden die Gewebe in Serummedium (0,4 % D-Glucose und 5 % fötales Rinderserum in MEM mit Earle-Salzen ohne L-Glutamin) mit einer feuerpolierten Glaspipette (111096, Kimble) verrieben. Die dissoziierten Zellen wurden mit einem Zellabscheider (93070, SPL) filtriert und vor der Aussaat im Serummedium bei 37 °C inkubiert. Nach der Zählung wurden die Zellen auf mit Matrigel (354234, Corning) beschichteten 12-mm-Deckgläsern in Platten mit 24 Vertiefungen mit etwa 110.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Hippocampuszellen wurden in neurobasalem Medium (10888-022, Gibco) mit B27-Ergänzung (17504-044, Gibco) und GlutaMAX (35050-061, Gibco) kultiviert. Am dritten Tag wurden in vitro (DIV) 20 μl mitotischer Inhibitor (5-Fluor-2′-desoxyuridin, Sigma; 4 μM in neurobasalem Medium) zugegeben, um Gliazellen zu hemmen. Die gesamte Bildgebung und Stimulation wird bei DIV 5–14 durchgeführt.

Primär kultivierte Hippocampus-Neuronen bei DIV 7–14 wurden für die elektrophysiologische Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet. Die Ganzzellaufnahmen wurden mit MultiClamp 700B (Molecular Devices, LLC, USA) unter einem Aufrechtmikroskop (Scientifica, EN) erstellt. Die Daten wurden bei 5 kHz gefiltert und bei 10 kHz mit einer Digidata 1550B-Schnittstelle (Molecular Devices) abgetastet, die von der Software Clampex 11.1 (Molecular Devices) gesteuert wurde, und mit Clampfit 11.2 (Molecular Devices) analysiert. Die Aufnahmen wurden bei Raumtemperatur gemacht. Die Glaspipetten mit einem Pipettenwiderstand von 3 bis 10 MΩ wurden aus Borosilikatglas (Harvard Apparatus, USA) gezogen. Die interne Lösung enthielt 74 mM KCl, 70 mM K-Gluconat, 0,2 mM EGTA, 4 mM MgATP, 10 mM HPEPS und 7 mM Na2-Phosphokreatin, eingestellt durch KOH auf pH 7,3. Die extrazelluläre Tyrode-Lösung enthielt 125 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 25 mM HPEPS und 51 mM D-Glucose und wurde mit NaOH auf pH 7,3 eingestellt. Nach dem Einbruch und der Ganzzellaufzeichnung wurden die Ruhemembranpotentiale jedes Neurons sofort gemessen. Die Dichtungswiderstände der Aufzeichnung betrugen 3 bis 10 MΩ. Rheobase war der aktuelle Schritt von mindestens 1 Sekunde, der mehr als ein Aktionspotenzial auslösen konnte. Eingangswiderstände wurden 1 s lang mit einem Stromschritt von –50 pA aufgezeichnet. Die Eingangswiderstände wurden anhand der Spannungsdifferenz zwischen der Grundlinie und den letzten 100 ms der Stromanlegung gemessen.

Tyrodes Lösung (125 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 51 mM D-Glucose (Sigma-Aldrich)) wurde für die gesamte Ca2+-Bildgebung für kultivierte Zellen vorbereitet. Das Fluo-4 Ca2+ Imaging Kit (Invitrogen) wurde zur Messung der Ca2+-Reaktionen kultivierter Neuronen verwendet. Das Protokoll für die Fluo-4-Bildgebung wurde von Invitrogen angegeben. Die Neuronen wurden 15 bis 30 Minuten lang in der Fluo-4-Lösung (1 mM) inkubiert und dann zur Bildgebung in Tyrodes Lösung ohne Fluo-4 überführt. 3,5 μl Magnetit-Nanoscheiben oder Hämatit-Nanoscheiben in einer Konzentration von 20 mg/ml wurden zu jeder Vertiefung mit 496,5 μl Lösung in einer Platte mit 24 Vertiefungen gegeben. Die Endkonzentration der Nanodiscs beträgt 70 μg/Well. Nach 5-minütiger Inkubation wurde das Deckglas mit dem Hippocampus-Neuron auf einen speziellen Tisch zum Anlegen eines Magnetfelds unter einem Fluoreszenzmikroskop (SS-1000-00, Scientifica) überführt. Für die Fluo-4-Bildgebung wurden Thorlabs-Lichtquelle (LEDD1B), Hamamatus C13440-Kamera und GFP-Filterwürfel (39002, Chroma) verwendet.

Ca2+-Aktivitätsvideos wurden auf einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop (SS-1000-00, Scientifica) im „.avi“-Format mit der HCImage-Software (Hamamatsu) gesammelt. Die Bildrate des Videos betrug 1 Hz. Die Videos wurden mit einem benutzerdefinierten Python-Skript auf Basis von opencv2 verarbeitet. Ein benutzerdefiniertes Python-Skript auf Basis von Numpy wurde zur Konvertierung der Fluoreszenzintensität in ΔF/F0 verwendet, indem der Algorithmus aus einer früheren Studie angepasst wurde11. Die Einzelheiten des Algorithmus und des Python-Skripts werden in den Zusatzinformationen beschrieben. Die aktivierte Zelle wurde durch die Zelle definiert, deren maximales ΔF/F0 in den angegebenen Zeiträumen mehr als 10 % betrug. Die Zellaktivitätsrate jeder Kulturprobe wurde durch den Prozentsatz der aktivierten Zellzahl dividiert durch die Gesamtzellzahl definiert. Weitere Einzelheiten zu den benutzerdefinierten Skripten finden Sie in den Zusatzinformationen.

Die Tyrode-Lösung ohne Ca2+ (125 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2,5 mM EGTA, 25 mM HEPES, 51 mM D-Glucose (Sigma-Aldrich)) wurde für Ca2+-freie Experimente vorbereitet. Der Inhibitor der TRPC-Familie SKF-96365 (Tocris) wurde der Tyrode-Lösung mit Ca2+ in einer Konzentration von 50 μΜ zugesetzt. Der TRPV4-spezifische Inhibitor HC-067047 (Sigma) wurde in einer Konzentration von 1 μΜ zu Tyrodes Lösung gegeben. Der Natriumkanalblocker Tetrodotoxin (TTX) (Abcam) wurde der Tyrode-Lösung in einer Konzentration von 100 nM zugesetzt. Der TRPC 1/6- und Piezo1-spezifische Inhibitor GsMTx4 (Abcam) wurde in einer Konzentration von 5 μΜ zu Tyrodes Lösung gegeben. Der TRPC 1/6 und der Piezo2-spezifische Inhibitor D-GsMTx4 (Tocris) wurden in einer Konzentration von 5 μM zu Tyrodes Lösung gegeben. Der TRP-Inhibitor 2-APB (Tocris) wurde der Tyrode-Lösung in einer Konzentration von 100 μΜ zugesetzt. In pharmakologischen Experimenten wurden kultivierte Zellen vor der Bildgebung mehr als 5 Minuten lang von Tyrodes Lösung mit Fluo-4 in die oben genannten Lösungen überführt.

Alle Tierversuche wurden von der NYCU IACUC gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der NYCU genehmigt. Alle Mäuse wurden von LASCO gekauft. Vor den Experimenten wurden die Mäuse im NYCU Laboratory Animal Center einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus ausgesetzt. In allen In-vivo-Experimenten wurden 8 bis 12 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse verwendet. PMAO-beschichtete Magnetit- und Hämatit-Nanoscheiben mit 1 mg/ml wurden einseitig in STN injiziert (AP: –2,06, ML: –1,5, DV: –4,5). Insgesamt 2 μl Nanodiscs in PBS wurden mit einer Mikroinjektionsspritze (7803-05, Hamilton) und einer Mikropumpe (Kd Scientific) injiziert. Nach einer Schädeloperation wurden Mäusen 0,2 ml Carprofen (PHR1452, Sigma-Aldrich) durch subkutane Injektion nach 0, 24 und 48 Stunden verabreicht, um postoperative Schmerzen zu lindern.

Zur c-fos-Färbung wurden mit Nanoscheiben injizierte männliche C57BL/6-Mäuse 5 bis 7 Tage nach der Nanoscheiben-Injektion in eine speziell angefertigte Spule zur magnetischen Stimulation in vivo gelegt. Mäuse wurden 90 Minuten nach der Magnetstimulation getötet. Zur Färbung von TRPC wurden männliche C57BL/6-Mäuse ohne Magnetstimulation verwendet. Zur Färbung fluoreszenzmarkierter MNDs wurden männliche C57BL/6-Mäuse am selben Tag oder 5 Tage nach der Injektion fluoreszenzmarkierter MNDs am STN getötet. Alle Gehirne wurden nach transkranieller Perfusion mit 4 % PFA in PBS gesammelt. Koronale Hirnschnitte wurden mit einem Vibratom (5100 MZ, Campden) mit einer Amplitude von 0,5 und einer Frequenz von 50 Hz geschnitten. Die Schnitte für die Immunfärbung hatten eine Dicke von 50 μm. Schnitte mit fluoreszenzmarkierten MNDs hatten eine Dicke von 150 μm. Die Hirnschnitte wurden dreimal 5 Minuten lang mit PBS gewaschen, die Schnitte wurden 15 Minuten lang mit 2 % (v/v) Triton X-100 (Sigma-Aldrich) permeabilisiert. Der Hintergrund wurde mit 2 % Triton-X-100, 30 % H2O2 und Methanol 10 Minuten lang geklärt; Nachdem die Schnitte dreimal mit PBS gewaschen worden waren, wurden die Schnitte 90 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 3 % normalem Ziegenserum in PBS blockiert. Die Scheiben wurden dreimal mit PBS gewaschen. Zur Immunfärbung wurden die Schnitte mit der ersten Antikörperlösung mit 1:750 monoklonalem Kaninchen-Anti-c-Fos-Antikörper (9F6#2250, Cell Signaling), 1:150 Maus-Anti-NeuN-Antikörper (Klon A60, #MAB377, MERCK) und 1 inkubiert :200 Anti-Kaninchen-NeuN (MABN140, Sigma-Aldrich), 1:100 Anti-Kaninchen-TRPC1 (SI-T8276, Sigma-Aldrich), 1:500 Anti-Maus-TRPC5 (N67/15, NeuroMab), 1:100 Anti -Kaninchen-TRPC6 (AB5574, MERCK), 1 % normales Ziegenserum und 2 % Triton-X 100 in PBS. Die Schnitte wurden 16–18 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Schnitte mit PBS wurden die Schnitte mit passendem Sekundärantikörper im PBS inkubiert (1:500 Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa-Fluor-488 (ab150113, Abcam) und 1:500 Ziegen-Anti-Maus-Alexa-Fluor-594 (ab150116, Abcam). Abcam)). Alle Scheiben wurden vor der Montage dreimal mit PBS gewaschen. Die Schnitte wurden mit einem Eindeckmedium mit DAPI (GTX30920, Genetex) auf Objektträger aus Glas montiert. Für die Bildgebung wurden ein inverses Fluoreszenzmikroskop (DMI3000, Leica), ein aufrechtes Fluoreszenzmikroskop (SS-1000-00, Scientifica), eine LED-Lichtquelle (pE300, CoolLED), eine Hamamatsu C13440-Kamera und Filterwürfel (39000, 19008, 31002, Chroma) verwendet .

Bei der Spule handelte es sich um eine Luftspule, die aus 2000 Windungen selbstklebendem Kupferdraht mit 18 AWG (SBWR, Chientai) bestand. Die Spule hatte einen Widerstand von 7 Ω und eine Induktivität von 60 mH. Bei der Stimulation mit einem variierenden Magnetfeld von 1 Hz wurden 0,6 A bis 2,8 A für die Stimulation mit 10 bis 50 mT verwendet. Bei einer 5-Hz-Magnetstimulation wurden 0,6 A bis 2,9 A für eine 10 bis 50 mT-Stimulation verwendet. Bei 10-Hz-Magnetstimulation wurden 0,6 A bis 3 A für die 10- bis 50-mT-Stimulation verwendet. Bei 20-Hz-Magnetstimulation wurden 0,7 A bis 3,2 A für die 10- bis 50-mT-Stimulation verwendet. Zur Erzeugung unterschiedlicher Magnetfelder mit Spule wurde ein speziell angefertigter H-Brücken-Treiber verwendet. Die H-Brücke bestand aus zwei p-Kanal-MOSFETs (IRF4905, International Rectifier) und zwei n-Kanal-MOSFETs (IRF3710, International Rectifier). Neben diesen vier MOSFETs wurden zwei weitere n-Kanal-MOSFETs zur Steuerung von P-Kanal-MOSFETs in H-Brücke verwendet. Der Arbeitsspannungsbereich wird durch zwei Widerstandspaare und Parameter des MOSFET gesteuert. Die Schaltung kann leicht geändert werden, indem ein anderer Widerstand oder MOSFET ausgetauscht wird. Zur Erzeugung von ± 5 V-Rechteckwellen wurde ein Funktionsgenerator (33210 A, Keysight) verwendet. Das Signal vom Funktionsgenerator durchlief einen Spannungsfolger und einen Wechselrichter (TLC2272, Texas Instrument). Die Verstärkungen von Spannungsfolger und Wechselrichter sind gleich eins. Die Phasen der Signale von Spannungsfolger und Wechselrichter weisen einen Phasenunterschied von 180° auf. Jedes Signal steuert eine Halbbrücke des Vollbrückentreibers. Für die Operationsverstärker des maßgeschneiderten H-Brücken-Treibers wurde eine interne Stromversorgung (Modell PS-3030DF, LONGWEI) verwendet. Zur Erzeugung magnetischer Felder in der Spule wurde eine externe Stromversorgung (IT6721, ITECH) verwendet.

Um von Spulen erzeugte Magnetfelder zu bewerten, verwenden wir die Software Finite Element Method Magnetics (Version 4.2), um Magnetfelder von Spulen in 2D zu simulieren (Abb. 2d, 5c). Bei der Programmeinstellung haben wir den magnetischen Problemmodus und die planare Konfiguration in FEMM4.2 verwendet. Die Parameter von Kupferdraht (12 oder 18 AWG) und Luft stammten aus der Materialbibliothek in FEMM4.2. Für die Magnetfeldmessung in der Spule wurde ein Gaussmeter (TM801, KANATEC) verwendet. Die Axialsonde wurde verwendet, um das Magnetfeld zu erfassen, das im Inneren der Spule erzeugt wurde.

Der Tod primär kultivierter Neuronen mit mehreren magnetomechanischen Stimulationen wurde mit Propidiumiodid (PI; P1304MP, Invitrogen) gemessen. Nach der Abbildung der Ca2+-Reaktionen primär kultivierter Neuronen mit Fluo-4 wurde PI zur extrazellulären Lösung hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 120 μM zu erreichen. Nach 5 Minuten wurde die Fluoreszenz von Fluo-4 und PI mit einem Fluoreszenzmikroskop (SS-1000-00, Scientifica) abgebildet. Es wurden Thorlabs-Lichtquelle (LEDD1B), Hamamatus C13440-Kamera und Filterwürfel (39002 und 39010, Chroma) verwendet.

Um ein gleichmäßiges Magnetfeld für die drahtlose neuronale Stimulation in vivo zu erzeugen. Für In-vivo-Experimente wurden vier maßgeschneiderte Luftspulen verwendet. Jede Spule besteht aus 500 Windungen aus 12 AWG Kupferdraht. Der Widerstand und die Induktivität jeder Spule betragen 1,02 bis 1,55 Ω bzw. 22 bis 31,6 mH. Wie in Abb. 6 gezeigt, werden vier Spulen in zwei Paare aufgeteilt, die übereinander gestapelt werden. Der Abstand zwischen den Spulen beträgt 4 cm. Als Treiber für jede Spule wurden Vollbrückenmodule (AQMH3615NS, AKELC) verwendet. Die Treiber wurden durch die von Arduino UNO (Arduino) erzeugten 5-V-Rechteckwellen gesteuert. Das Arduino-Board wurde durch ein maßgeschneidertes Skript mit der Arduino IDE gesteuert. Die Einzelheiten des Arduino-Codes wurden in den Zusatzinformationen beschrieben. Die interne Stromversorgung beträgt 5 V und wird von Arduino bereitgestellt, um die Arbeitsspannung für Vollbrückenmodule bereitzustellen. Für die Stromversorgung der Spulen wurde ein externes Netzteil (Modell HJS-1000, HuntKey) verwendet. Für In-vivo-Experimente wurden 10-A-Ströme zur Erzeugung eines gleichmäßigen Magnetfelds mit 50 mT bei 10 Hz in den Spulen verwendet.

Alle Tiere gewöhnten sich vor der Magnetstimulation mindestens 45 Minuten lang an den Verhaltensraum. Die Zylinderarena bestand aus Polymethylmethacrylat mit einem Innendurchmesser von 20 cm und einer Höhe von 16 cm und passte in den maßgeschneiderten Magnetapparat. Die wachen Mäuse wurden in die Zylinderarena in der Mitte der Spule gelegt und von oben mit der Kamera aufgenommen. Vor der Stimulation erfolgt eine 5-minütige Vorstimulationsperiode ohne Anwendung von Magnetfeldern, gefolgt von einer 10-minütigen magnetischen Stimulationsperiode. Während der magnetischen Stimulationsperiode wurden 10 Mal eine 30-sekündige Stimulation durch ein alternatives Magnetfeld (50 mT bei 10 Hz) und 30-sekündige Zwischenstimulationsintervalle ohne Magnetfeld angewendet. Dieses Magnetstimulationsverfahren wurde zur Untersuchung der neuronalen Aktivität mit c-fos und für Rotationsverhaltenstests eingesetzt. Das zuvor berichtete DeepLabCutTM (DLC)48 wurde zur Verfolgung markloser Mäuse in den aufgezeichneten Verhaltensvideos verwendet. Zur Analyse des Rotationsverhaltens wurde ein maßgeschneiderter Python-Code verwendet. Eine detaillierte Beschreibung und Skripte finden Sie in den ergänzenden Methoden.

Alle Statistiken wurden in JASP (v0.14.1.0, JASP-Team) durchgeführt. Alle Fehlerbalken in den Punktdiagrammen geben den Standardfehler des Mittelwerts (Sem) an. Alle grauen oder rosafarbenen Bereiche in den Spuren der Fluoreszenzänderungen zeigen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) an. Zum Vergleich gepaarter Daten wurde der Wilcoxon-Signed-Rank-Test verwendet. Zum Vergleich ungepaarter Daten wurde der Wilcoxon-Rangsummentest verwendet. Für den Vergleich von Daten mit zwei Faktoren wurden der Tukey-Post-hoc-Test und die Zwei-Wege-ANOVA verwendet. Zum Vergleich der Daten mehrerer Gruppen wurden der Dunn-Post-hoc-Test und der Kruskal-Wallis-Test verwendet. Die Anzahl der einzelnen Zellen, Proben (Einzelkulturen) und Tiere jedes Experiments ist in den Legenden der Abbildungen und Tabellen angegeben

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Quelldaten, die den in der aktuellen Studie verwendeten Zahlen zugrunde liegen, finden Sie in den Zusatzdaten 1. Alle anderen Daten sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Der Code zu dieser Studie ist im Abschnitt „Methoden“ der Zusatzinformationen verfügbar.

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Wir danken P. Ankieeva, D. Gregurec und F. Koehler für die Beratung zu Materialien und Elektronik. Diese Forschung wird vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST), Taiwan (ROC) finanziert (108-2636-B-009-006; 109-2636-B-009-008; 110-2636-B-A49-003).

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Chih-Lun Su, Chao-Chun Cheng.

Institut für Biomedizintechnik, Nationale Yang Ming Chiao Tung Universität, Stadt Hsinchu, Taiwan, Republik China

Chih-Lun Su, Chao-Chun Cheng, Ping-Hsiang Yen, Jun-Xuan Huang, Yen-Jing Ting und Po-Han Chiang

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Konzeptualisierung: PHC, CLS Methodik: PHC, CLS, CCC, PHY, JXH Untersuchung: CLS, CCC, PHY, JXH, YJT Formale Analyse: CLS, CCC, JXH, YJT Visualisierung: CLS, CCC, PHY, JXH, YJT, PHC Finanzierungseinwerbung: PHC Projektverwaltung: PHC Aufsicht: PHC Writing – Originalentwurf: PHC Writing – Überprüfung und Bearbeitung: PHC, CLS, CCC, PHY, JXH, YJT

Korrespondenz mit Po-Han Chiang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Rahul Srinivasan und Xiaoming Jin für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Eliana Scemes und Gene Chong. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Su, CL., Cheng, CC., Yen, PH. et al. Drahtlose Neuromodulation in vitro und in vivo durch intrinsische TRPC-vermittelte magnetomechanische Stimulation. Commun Biol 5, 1166 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04124-y

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Eingegangen: 14. Februar 2022

Angenommen: 17. Oktober 2022

Veröffentlicht: 02. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04124-y

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Drahtlose Neuromodulation in vitro und in vivo durch intrinsisches TRPC